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土壤微生物基因组DNA抽提实验说明

发布时间:2017/06/07 点击量:

(还可以提取如沉积物,排泄物,废水,雪水等样品的DNA)土壤微生物基因组DNA抽提试剂盒/提取试剂盒

(利用硅吸附DNA原理)

一,说明

本试剂盒可以在30分钟内快速有效的直接从土壤分离微生物基因组DNA。用上海净信科技(全自动样品快速匀浆机)FSTPRP仪器(将样品与缓冲液加入带有特殊小珠的样品管/离心管)在40秒内可以裂解土壤中的植物、动物组织、细菌、藻类、真菌孢子、酵母、线虫。经过本试剂盒的分离纯化,所得的DNA可以用于PCR、限制性酶切、电泳和其他使用。

浓缩SEWS-M使用前加入25ML无水乙醇,并在瓶子上做好标记,盖好瓶盖

WASH D使用前加入56ML无水乙醇,并在瓶子上做好标记,盖好瓶盖

用1ML  ddH20(灭菌)完全溶解RNA酶,将RNA酶放入水中煮,水沸后再煮沸20分种,并掉炎,缓慢冷至室温后,将RNA酶取出,全部加入 sodium phosphate buffer中,充分混匀后,将sodium phosphate buffer buffer 放入4度保存。

试剂盒组成

二,步骤

加入500MG 土壤样品到一个样品管中,管中应管有0.05-0.1ml  空间。

(注意一,为使样品尽可能遥多均匀,一个样品一般取四个管,两管并一管,得到两管的DNA,注意二,在试验中,可用普通离心管+氧化锆珠(0.8g),注意三,应将放在-20度的样品上一天取出化冻)

加入0.1956ml  sodium phosphate buffer 到样品中

加入0.0244ml MT buffer 到样品中

用上海净信科技(全自动样品快速研磨机机)仪器以速度14单位频振60S 反复三次(确保完全可以粉碎)

13000rmp  离心5-10min ,沉淀碎片    (注意一,加一步去除腐酸的步骤:取上清到10研磨单位离心管,加入。。。。。。。。。。。。。颠倒混匀,2MIN   12005MIN看不清)

将上清(约0.12ml)转移到一个干净的2研磨单位离心管中,加入0.05ml  PPS到管中,用手颠倒混匀10次。

13000RPM 离心5MIN 以沉淀蛋白质,转移上清到一个干净的2研磨单位离心管中(约0.14ml)

加入1ML Binding solution b(5倍体积)到2研磨单位离心管中,用手颠倒混匀2MIN (提前水加热,促进DNA与硅胶给合)

将结全柱放入2ML收集管中,净混合液加入结合柱中,室温放置2 min.(分三次加,每次加0.12-0.14ml两管并一管)

13000RPM离心1MIN,倒掉收集管中的废液,将结合柱重新放入2研磨单位离心管中。

加入0.1ml SEWS-M(Spin-buffer)到结合柱中,13000RPM离心1MIN,倒掉收集管中的废液。

注去注腐殖酸

在1.5研磨单位离心管中制备腐殖酸洗涤溶液:

Sodium phosphate buffer  978UL

MT  buffer            0.0244ml

Pps:                  250ul

混匀,13000RPM离心1分种转移上清液于一个干净的2研磨单位离心管中。

加入等体积的5M Guanidine Thiocyanate sojution 混匀。

加入0.1ml 腐殖酸洗涤液到步聚11中的结合术中,13000RPM离心1分种,倒掉收集管中废液。

重复上述步骤三次

接步骤十二

加入0.13mlwashD  于结合柱中,13000RPM离心1MIN,倒掉收集管中的废液。

将结合柱装入离心管中,130000RMP离心2MIN

将结合柱装入1.5研磨单位离心管中。室温放置五分种,以便乙醇挥发干净,在膜中央小心加入,0.015ml DES  。不要戳破膜,室温放置2MIN。(37度  30MIN)

13000RPM离心1MIN 离心管中即为分离的DNA,贮存于-20度或进入下一步室实验。(应将2管DNA混于一管,混匀,再分成两管,这样即能得到4管一管的目的。目的是尽量消除样品内部差异)

本实验不用去除腐殖酸这一步,但有文献指出,在-20度时,腐殖酸仍会降解DNA,

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