土壤微生物基因组DNA抽提实验说明

（还可以提取如沉积物，排泄物，废水，雪水等样品的DNA）土壤微生物基因组DNA抽提试剂盒/提取试剂盒

（利用硅吸附DNA原理）

一，说明

本试剂盒可以在30分钟内快速有效的直接从土壤分离微生物基因组DNA。用上海净信科技（全自动样品快速匀浆机）FSTPRP仪器（将样品与缓冲液加入带有特殊小珠的样品管/离心管）在40秒内可以裂解土壤中的植物、动物组织、细菌、藻类、真菌孢子、酵母、线虫。经过本试剂盒的分离纯化，所得的DNA可以用于PCR、限制性酶切、电泳和其他使用。

浓缩SEWS-M使用前加入25ML无水乙醇，并在瓶子上做好标记，盖好瓶盖

WASH D使用前加入56ML无水乙醇，并在瓶子上做好标记，盖好瓶盖

用1ML  ddH20（灭菌）完全溶解RNA酶，将RNA酶放入水中煮，水沸后再煮沸20分种，并掉炎，缓慢冷至室温后，将RNA酶取出，全部加入 sodium phosphate buffer中，充分混匀后，将sodium phosphate buffer buffer 放入4度保存。

试剂盒组成

二，步骤

加入500MG 土壤样品到一个样品管中，管中应管有0.05-0.1ml  空间。

（注意一，为使样品尽可能遥多均匀，一个样品一般取四个管，两管并一管，得到两管的DNA，注意二，在试验中，可用普通离心管+氧化锆珠（0.8g）,注意三，应将放在-20度的样品上一天取出化冻）

加入0.1956ml  sodium phosphate buffer 到样品中

加入0.0244ml MT buffer 到样品中

用上海净信科技（全自动样品快速研磨机机）仪器以速度14单位频振60S 反复三次（确保完全可以粉碎）

13000rmp  离心5-10min ，沉淀碎片    （注意一，加一步去除腐酸的步骤：取上清到10研磨单位离心管，加入。。。。。。。。。。。。。颠倒混匀，2MIN   12005MIN看不清）

将上清（约0.12ml）转移到一个干净的2研磨单位离心管中，加入0.05ml  PPS到管中，用手颠倒混匀10次。

13000RPM 离心5MIN 以沉淀蛋白质，转移上清到一个干净的2研磨单位离心管中（约0.14ml）

加入1ML Binding solution b（5倍体积）到2研磨单位离心管中，用手颠倒混匀2MIN (提前水加热，促进DNA与硅胶给合)

将结全柱放入2ML收集管中，净混合液加入结合柱中，室温放置2 min.(分三次加，每次加0.12-0.14ml两管并一管)

13000RPM离心1MIN，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2研磨单位离心管中。

加入0.1ml SEWS-M（Spin-buffer）到结合柱中，13000RPM离心1MIN，倒掉收集管中的废液。

注去注腐殖酸

在1.5研磨单位离心管中制备腐殖酸洗涤溶液：

Sodium phosphate buffer  978UL

MT  buffer            0.0244ml

Pps:                  250ul

混匀，13000RPM离心1分种转移上清液于一个干净的2研磨单位离心管中。

加入等体积的5M Guanidine Thiocyanate sojution 混匀。

加入0.1ml 腐殖酸洗涤液到步聚11中的结合术中，13000RPM离心1分种，倒掉收集管中废液。

重复上述步骤三次

接步骤十二

加入0.13mlwashD  于结合柱中，13000RPM离心1MIN，倒掉收集管中的废液。

将结合柱装入离心管中，130000RMP离心2MIN

将结合柱装入1.5研磨单位离心管中。室温放置五分种，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入，0.015ml DES  。不要戳破膜，室温放置2MIN。（37度  30MIN）

13000RPM离心1MIN 离心管中即为分离的DNA，贮存于-20度或进入下一步室实验。（应将2管DNA混于一管，混匀，再分成两管，这样即能得到4管一管的目的。目的是尽量消除样品内部差异）

本实验不用去除腐殖酸这一步，但有文献指出，在-20度时，腐殖酸仍会降解DNA，