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    实验案例

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    提取组织器官RNA|净信多样品组织匀浆机实验案例

    发布时间:2020-07-24 01:35:16 点击量:

    组织样品中RNA的提取实验:本实验的组织样品主要有小鼠的各个组织器官(如肝脏,肌肉,脂肪等)和人肿瘤标本(如结直肠癌,肺癌,乳腺癌)
     


      1.首先要根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的TRIZOL液体,同时加入若干颗不锈钢柱。本实验室一般情况如下:(小鼠组织加入TRIZOL,结直肠癌标本加入TRIZOL)

      注意:

      a.用净信匀浆机进行匀浆处理时样品体积最好不要超过TRIzol体积10℅)

      b.需事先预冷试管座

      2.把加入样品,TRIZOL,不锈钢柱的Axygene EP管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子,点击运行

      3.机器运行完毕后,打开盖子,拿出净信EP管仔细观察组织的研磨情况,如果没有明显的块状物,那就可以进入下一步实验步骤,如果没有完全打碎,还需要把EP管放入试管座中,继续匀浆。有些坚硬,或者脂肪含量高的组织(乳腺)可能需要稍微长一点的时间,时间可以依据组织实际的研磨情况来调整匀浆时间。

      4.和传统的TRIZOL提取RNA的方法一样,将匀浆样品在室温放置几分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。

      5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡若干秒,室温放置几分钟。

      6.2-8℃10000×g离心十几分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。

      7.把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入异丙醇,室温放置几分钟。

      8.2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

      9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心几分钟,弃上清。

      10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入无RNase的水,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。

      常见问题分析:

      1得率低:

      A.样品裂解或匀浆处理不彻底

      B.RNA沉淀未完全溶解

      C.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高

      D.样品匀浆时加的试剂量太少

      E.匀浆样品时未在室温放置几分钟

      F.吸取水相时混入了有机相

      2 RNA降解

      A.组织取出后没有马上处理或冷冻

      B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

      C.细胞在用胰酶处理时过度

      D.溶液或离心管未经RNase去除处理

      E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

      3 DNA污染:

      A.样品匀浆时加的试剂量太少

      B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液

      预防RNase污染注意事项:

      1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。

      2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

      3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

      4.配制溶液应使用无RNase的水

      本实验已经研磨的各个组织中发现肝脏组织是最容易研磨,研磨效率是最好的。

      下图A是RNA经过传统的液氮研磨和匀浆器研磨法抽出的RNA跑胶图,结果很明显发现这种方法是可行的,是可以代替传统的方法的。

     


      下图B是利用组织匀浆器对小鼠的各个组织进行匀浆抽出的RNA跑胶图。发现在抽提各个组织的RNA的时候也是可行的。
     


      图C是利用组织匀浆器对人结肠癌标本进行了研磨后抽提出的RNA的跑胶图。
     


      图D是小鼠的肝脏组织经过手工研磨和机器匀浆后,最后抽提得到的RNA进行了浓度的测定,结果说明组织匀浆器抽提出得RNA的浓度要显著高于传统的手工的方法得到的RNA。
     


      蛋白质的提取

      A.根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的蛋白质裂解液(如RIPA),同时加入3颗不锈钢柱。(小鼠肝脏组织加入1mlRIPA蛋白裂解液,人结直肠癌组织加入500ulRIPA蛋白裂解液)

      B.把加入样品,蛋白裂解液,不锈钢柱的Axygene EP管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子,点击运行。

      以下同上RNA的操作方法

      最终所得到的蛋白质浓度的测定经过BCA试剂盒测定完成的,同时通过SDS-PAGE后经过考马斯亮蓝染色和western blot检测都发现其要比传统的方法更加简便快捷,不容易引起交叉污染。

      更多实验细节可致电工作人员!

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